编者导语
非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容，以飨读者。承接上期，本期袁老师为大家带来离子抑制的精彩解读。
作者简介
袁超博士
现任美国华人临床化学学会主席，美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位，其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后，主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。
第八节 离子抑制
要想理解质谱里的基质效应，必须先了解离子抑制。这两个概念有很大的关联性，但绝对不是同一回事。就好像收入和利润的关系，都跟挣钱有关，但差别还是相当显著的。
同样量的内标加在不同的样品里，最后出来的内标的丰度不尽相同，这里面有很多原因。隐藏在其中的一个原因就是离子抑制。要想理解离子抑制，咱们先得把其它的原因去除掉。
第一个原因就是LCMS本身的变数。即便是同一个样品，比如一个标准品，测几遍，每遍的结果都不会完全相同。那同一个样品测n遍，怎样的CV才算可以接受呢？这个没有统一的规定，当然越小越好。有些检测项目的最大允许误差（total allowable error，简称TEa）是公布了的，一般在20% 到30%之间。所以同一个样品由不同的人在不同的日子里测n遍，一般小于20%的CV是可以接受的。但这个20%包括了人与人，天与天之间的差别。连续测同一个样品的CV要远远小于20%才行。我自己的标准是3-6%。3%是优秀，6%是及格。这就好像我总共有20块钱来吃午饭，我可以拿出来3到6块花在路费上，剩下的钱用来买饭。要是花了15块路费，这午餐就很紧张了，很容易超支。这样的方法就不要往下做了，需要反炉重新优化。
这个3-6%是指浓度，或者被测物和内标的比值的CV。如果只算内标峰面积的CV，我个人认为应该在6-10%之间，6%是优秀，10%是及格。根据是什么呢？没有非常科学的根据，自己的经验得来的。如果非要找根据，那就是sigma了。20%除以6%是三，20%除以3%是六；三个sigma是及格，六个sigma是优秀。sigma的算法和意义以后再讨论。内标的CV一般会比【被测物和内标的比值】的CV大一些，翻个一番，到6%～10%的范围，是正常的。这也是我们为什么用内标的初衷，就是用来消减被测物信号的CV。
同一个样品测n遍，内标的CV在10%以内；那同样的量的内标放在不同的病人样品里，怎样的CV算合适呢？没有统一的标准，你个人认为把10%再翻一番，20%。这个值还是越小越好。能做到10%以内就算好方法了，这样的方法上了临床以后麻烦也会少。需要注意一点的是要让仪器预热好了再测，要不然的话，内标变化过大有可能是仪器还没有稳定造成的。尿液里的成分变化太大，很难达到小于20%的要求，可以放宽一些，甚至到50%。这样做是合适的，因为尿里的浓度已经跟血液浓度没有严格的相关性了，定性大于定量，除非是24小时尿。如果对尿液浓度的测量真的要求很高，那最好还是把CV做到20%以内。如果被测物浓度够高或者质谱仪够灵敏，那么一个简单的办法就是稀释。任何的样品，不管是血样还是尿样，稀释100倍以后，肯定没有离子抑制了，内标的CV也会很稳定。
把内标的CV尽量做的小的好处是什么呢？那就是能更好得看到其它的东西。打一个比方，坐在摇晃的车里写字，车摇晃的厉害了，写的什么字就看不出来了。要想看清写的字，就要把车的摇晃度给降下来。车开得越稳定，越能写更小的字。内标的CV就像车的摇晃度，越小才能看见手的细微动作。
CV降下来以后我们要看什么呢？看outlier，看内标太高或太低的点。如果绝大部分病人的内标都在平均值的上下10%以内，那突然有一个点在20%，那这个点就是outlier。如果内标的CV在40%，那只有60%以外的点才能算outlier，就好像坐在走山路的车里，颠簸得太厉害，只能写大字了，只能看到很离谱的outlier了。
某个病人样品里的内标太高或太低，成了与众不同的outlier，这是个警告，这里面有很多信息，有很多原因。内标太高或太低时，测得的病人结果有可能是不准的。直接把这样的结果送出去是可能会对临床产生负面影响的。内标outlier的成因可以大致分为两类，一类是不可重复的，另一类是可重复的。不可重复的有很多原因。第一，内标加的体积不对，少了或多了。气泡会导致少，tip外面多挂一滴会导致高。不小心加了两次内标也会导致高。第二，样品的体积不对。加少了会导致内标高，加多了会导致内标少。第三，进样量不对。加样时要是混进了个大气泡，会导致内标减少。这个有时可以从液相的压力曲线上看的出来。第四，液相什么地方漏了，样品有丢失。一般这种情况下，后面的所有的样品的内标都低。以上这几种情况都是不可重复的。一个方法既然已经上临床了，那表现肯定是不错的，在大部分的情况下，是不应该出现上述的情况的。如果真的出现了，那重复一次还会同样发生的几率是小之又小。如果真是体积加错了，是能检测出来的，有时肉眼都能看得出。如果再测一次，内标是好的，病人结果跟第一次一样，那就有可能是LC进样时有了气泡或者哪里漏了。如果第二次的结果跟第一次不一样，那就再测一次，看能不能重复第二次的结果。如果可以，那就说明第一次有可能是体积加错了。总之，这几种原因导致的内标升高或降低是不可重复的，再做一次可能就正常了。
如果再做一次，甚至再做两三次，内标总是偏高或偏低呢？这就是样品本身引起的了，是可以重复的。这里面又分为两个原因，一个是离子抑制，也就是本节的主题，另外一个是干扰物。离子抑制也是由干扰物引起的，但这个干扰物是看不见的，峰的形状没有异常，只是峰面积小了。能看得见的"干扰物"是会把峰型给搞糟的，多了个峰肩或有拖尾。看的见的干扰物以后再说，这里只讲看不见的干扰物，也就是离子抑制。在这种情形下，病人的血液里有一种物质，可以把内标的信号给抑制掉，这就是离子抑制。
离子抑制一般发生在离子化这一步。离子化是链接色谱和质谱的关键步骤。离子化其实是和气化几乎同时发生的。这个过程就像一只水枪包括在一个通了电的吹风机里。被检测物和内标从水枪里出来，周围夹裹着吹风机里吹出的热气，附近还有高压电。最后的结果是热气把液体蒸发了，高压电把分子给离子化了。只有这样，赤裸的带电离子才能飞进质谱，被检测到。
如果病人的样品里有这么一种物质，比如是一种药物或药物的代谢物，它正好和被检测物同时从那液相里出来，同时被离子化。如果这种物质的浓度够高，那么它就会和被检测物以及内标去争抢离子。争抢的结果就是被检测物和内标的离子化不完全，产生的离子少了，信号自然就弱了，就变成outlier了。而且这个outlier是可以重复的，因为那个药品存在在样品里，测多少遍都是那个时候出来，跟被测物抢离子。
离子抑制怎样确避免呢？样品稀释一下就可以做到。样品稀释以后，一块儿出来的其它物质就被稀释掉了，但是内标加的还是一样多。敌人少了，内标的浓度没变，争抢离子的战斗就会偏向内标这一方。最后的结果就是内标的峰会升高（但不会高到跟平均值一样的水平，因为敌人只是减少了，并没有消失），但是被测物和内标的比值不变。也就是测得的结果在考虑到稀释的倍数以后是不变的。如果稀释后是这样的情形，内标向平均值靠拢，而且测得的结果不变，那内标减少的原因就是离子抑制。测得病人的结果是可以出具的。
在用稀释来解决离子抑制的过程中，有个很有趣的现象，每次都能重复出现，那就是稀释一倍以后的内标会好一些，但总达不到预期的水平。比如不稀释的话，内标被抑制了50%，那稀释一倍以后应该是被抑制25%。但实际操作中往往是在30%左右，靠近黄金分割的那个比例，0.618。它离不稀释的内标值的距离近一些，是4；离均值远一些，是6。这里面肯定有什么规律在里面，但是我还没有找到令人信服的科学依据。我只能用一个生活中的例子来大概解释一下：没有离子抑制的样品干净，像牛奶；有离子抑制的样品脏，像咖啡。把牛奶咖啡混在一起，颜色居中，但更偏向咖啡一些。就好像把一滴牛奶滴到咖啡里，咖啡还是咖啡的颜色；把一滴咖啡滴到牛奶里，牛奶就会有咖啡色。
在此总结一下本节的内容：
1. 病人样品里的某种物质在离子化时跟被测物竞争，导致信号降低，造成离子抑制。
2. 离子抑制是可重复的，与样品制备无关。
3. 离子抑制是可以用稀释法来消除的。
4. 离子抑制只有在特殊的情况下才有可能会造成定量的偏差。
能通过稀释来解决的离子抑制还不叫"基质效应"；基质效应是稀释解决不了的离子抑制。关键的关键，是用什么溶液做稀释以及用什么溶液来配标准品。这个留到下一节来讲。
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