编者导语
非常荣幸邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的精彩干货内容，以飨读者。本期袁老师为大家带来干扰物的精彩解读。
作者简介
袁超博士
现任美国华人临床化学学会主席，美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位，其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后，主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。
第十节 干扰物
干扰物是临床检测的方法验证里必做的一项。但是干扰物对不同的科室来说，含义大不一样。如果说临床化学是一棵树的话，每一个科室，比如化学，免疫，还有质谱，只是这棵树上的一个分支。干扰物就像树上的鸟，分别站在每一个枝头。但是此鸟非彼鸟，化学方法里的干扰物在很多情况下是不会干扰免疫和质谱方法的。但因为历史的原因，每次验证质谱方法时都要把化学方法里的干扰物测一遍，而该测的干扰物往往漏掉了，在后来的工作中会造成麻烦。所以质谱法的干扰物测定要有特殊的程序。
化学光吸收法里的干扰物主要是溶血，脂血，和黄疸，因为这些物质都可能吸收、反射、或折射光波。免疫法里要测的干扰物应当包括各种自身抗体，人抗动物抗体、抗试剂抗体、生物素、交叉反应，等等能影响抗体抗原反应的物质。免疫法并不是一个直接的检测手段，要通过抗原抗体的结合来发生。而抗体抗原反应又比较复杂，容易被干扰。这也是大家普遍认为质谱法特异性更好的原因。在质谱检测里，被测物从上千种物质里逐步被分离出来，最后撞在光电倍增管里，产生一个电子信号，作为定性和定量的基础，其特异性是其它方法不可比拟的。但这不表示质谱法里就没有干扰物了。
在液质联用的方法里，能成为干扰物是一件很不容易的事情，必须和被测物是isocratic 和 isobaric。也就是说在色谱上和在质谱上都是分不开的。色谱的分离是基于疏水性，分子结构等理化性质。如果某种物质的理化性质和被测物相近，那就会和被测物一起从色谱柱里出来。如果这个物质不能被质谱检测到，那就只是会和被测物以及内标争抢离子，形成离子抑制。如果它正好和被测物的分子量相同，而碰撞断裂后有相同的离子片段，那就会被质谱检测到，成为“能看得见”的干扰物。
干扰物往往不会和被测物的保留时间完全一样，这样就形成了一个多余的峰肩，在主峰的前或后。干扰物的峰型有可能不对称，因为我们的色谱梯度不是针对干扰物来设计的。这种情况下就会形成拖尾。这样的峰与被测物的峰叠加在一起，形成不正常的峰型，很容易被看出来。不单单是被测物有干扰物，内标也会有干扰物。内标的干扰物往往会把内标的峰面积增加，很容易被看出来。在方法开发时，可以做一批不加内标的病人样品，看哪一个离子对比较干净，就选用哪一个。方法开发好上了临床以后会碰到很多意想不到的问题。一般一个新方法上临床一年以后没有问题才算可靠。季节性的药物，新药，新的抽血的管子，新的试剂，新的包装等等，这些都有可能含有干扰物。所以在方法开发和验证时可以多选用几个备用的离子对，一旦有干扰物，可以顶上。一般选2-4个。
说起离子对的选择，这里面的学问很多。大多数人是选丰度最高的那一个。我的经验是选丰度高的离子对不如选特异性好的。掉水，掉氨基，掉羧基，掉甲基、掉乙基的离子对特异性都不会好；碎片是苯环或苯环类似物的也不好；如果用延伸的话，要注意不要用延伸化试剂的离子。内标的片段最好也是选用特异性的片段。比如掉HDO的片段就比掉H2O的特异性高很多。实际情况不可能保证每个化合物都能找到2-4个可用的离子对。有时候只能退而求其次。甚至连【母离子-母离子】这样的离子对我也用过。这个化合物就像个硬核桃，你用锤子敲它，劲儿使小了砸不开；劲大了，砸碎了，一地渣渣，找不出一个可用的片段。我只好选用了一个比把它砸碎了的能量小一点的碰撞电压，希望这个电压能把可能有的干扰物砸碎，但我要的核桃还是完整的。另外一个比较奇特的例子是碰撞后的不稳定性。这个化合物在碰撞后可以丢A基团，也可以丢B基团，但两个的信号都不稳定。这时候我选用了两者之和，信号才算是稳定下来了。不稳定的情况还会发生在离子化这个阶段，尤其是溶液中的离子，比如盐，有可能附加在被测物之上，这样的话，会造成信号不稳。这个时候就要用一个小的电压去敲一下被测物，希望能把这个附带的离子敲下去。当然，这一步发生在进Q1之前，不同厂家对这个电压有不同的叫法。在这个环节还有一个气体，它的流动方向是跟离子运动的方向是相反的。我的经验是在不影响信号强度的情况下，把这个气的流速调的越大越好。因为反方向吹，可以把杂质吹走。这个气的使用和以前手工扬麦的原理相似：麦子落下时，风可以把瘪的麦粒和麦皮给吹走了，饱满的麦粒垂直落下来，被纯化、富集。所以这个风速要调到大的刚好吹不走麦粒，才能减少污染物，干扰物。建一个稳定的、干净的、污染物少的质谱方法有很多窍门。因为篇幅限制，我不可能一一列举，先讲到这里。关键是要对仪器的各种参数的了解、运用、思考、和试错。
不管事前准备的多充分，实际情况是出乎意料的复杂。干扰物的出现往往防不胜防。怎样去发现有干扰物呢？除了看得见的峰型的改变，还有两个指标。一个是离子对的比值，一个是保留时间。如果我们检测两个以上离子对，那他们之间的比值应该是相对固定的，如果偏高或偏低，那就是有干扰物了。偏高或偏低的界定在CLSI的法规里有。一般对低丰度的离子的要求相对较宽泛。所以在具体操作时可以在合乎规定的范围内做出对运营有利的选择。比如人为的加大碰撞电压，使定性的离子对的丰度降低，低到是定量的离子对的丰度的10%以下，这样就可以按照规定选用一个比较宽的范围。还有一些其它技巧，比如同一离子的多次使用，因为用文字解释起来比较复杂，我就不在这里介绍了。法规里一个值得改进的地方是对浓度低的要求应该宽泛一些，因为这时候信号和噪音的差别已经不大了，尤其是到了已经没有临床意义的低浓度时。另外，厂家的软件也有待改进，浓度低时，如果离子对比值超标，这样的峰就不要特殊的标出来了，直接给个小的定量就可以了；如果定的量在LOQ之下，就没有必要再去深究是不是有干扰物把离子对的比值搞乱了。离子对的比值按理是应该不变的，但是除了上述的浓度之外，还有其它因素。比如不同仪器，尤其是不同厂家的仪器之间；每次做完仪器维修之后；不同的流动相，等等，这些因素都会改变不同离子对之间的比值。有的厂家的软件设计的比较合理，是自动选用同一批次里的标准品的离子对比值来衡量病人样品。这样就会把其它干扰因素给去掉。
从保留时间也可以看出有没有干扰物。不是看绝对的保留时间，也不是看相对保留时间（相对保留时间是用在内标是类似物的情况下），而是看被测物和内标的保留时间的差值。氘标记的内标疏水性差，从反向柱出来的时间会稍早一点儿。如果是被测物先出来的话，就有可能混的有干扰物了。具体用什么范围来衡量要从实际中来。标准品和质控品干净，没有干扰物。把他们的时间差算个平均数，范围是正负2SD或3SD就可以了。注意要在计算时把软件里保留时间的小数点后面多放几位。保留时间的差值超出范围，甚至峰型都被改变了，也不见的就肯定有“看得见”的干扰物。有可能是“看不见”的干扰物捣的乱。这时，“看不见”的干扰物只抑制了被测峰的部分（前半部或后半部），所以才会把峰型搞乱，把保留时间挤的靠前或靠后，这时候可以用稀释法来检测（见上节）。最麻烦的是“看得见”和“看不见”的干扰物同时存在，使得结果很不可靠。这时候就只能说“因为有干扰物而出不了报告了”。另外干扰物有可能是上一个样品里的，因为色谱没有洗干净，杂质被带到了下一个样品里来了。把被干扰的样品重新上次一样就可以解决这个问题。有的杂质多的样品会干扰接下来的两个，甚至三个样品，或者直接就把色谱柱子给毁了。重复测一次，它又毁一根柱子。这种时候 ，我都想找客户倒赔我们钱。这种都是极端的例子，有些确实是因为病人在进行一项特殊的治疗，血液里有大量的特殊药物。如果这种毁柱子的情况经常出现的话，说明方法不够好，需要把样品弄的更干净些再进样。
如前所述，如果某个病人的内标的峰面积过大时，也可能是因为干扰物引起的。所以内标最好也要使用几个离子对。很多法则里对内标的离子对数目没有硬性规定。但是我个人感觉还是有至少两个比较好。
另外，还要把干扰物和污染物区别开。污染物就是被测的物质，但是不应该出现在样品里。它的产生原因五花八门。例如实验操作不规范，使用天平时没有清理干净，把后面的试剂、溶液给污染了；厂商在产品制造过程过程中无意中引进的污染；员工本身无意引进的污染（吸烟者的尼古丁，怀孕妇女超高的雌激素，等等）。这种情况下，空白和双空白可以看出来。另外每次从厂家收到内标以后，都要单独检测一下，看里面有没有不带标记的被测物。虽然软件里可以用数学的方法把内标里混进去的被测物去掉，但最好是拿到干净的内标为最好。
如果真的出现干扰物了，怎么办？首先是换一下离子对，看问题能不能解决。如果备用的离子对是好的，而且也被验证过，那报告是可以出的。如果发现大多数被干扰的样品都可以用备用的离子对解决，那可以考虑永久的换一下离子对。有时候自己实验室解决不了，可以把样品送到其他实验室，换一个方法说不定就不干扰了。
建质谱方法时，要测试可能成为干扰物的类似物。可以查文献看以前有哪些报道；可以查分子库，看有没有分子量相近的化合物。有的话，要拿来测一测。这个要比测溶血，脂血更有意义。
本节的总结：
1. 质谱法的干扰物有别于其他方法，只有色谱和质谱都分不开的物质才有可能成为干扰物。
2. 干扰物可以从峰型，保留时间，和离子丰度比值来鉴定出来。
3. 解决干扰物的问题要从建方法时开始，需要有大量的仪器操作和方法开发的经验。
4. 真是有解决不了的问题，只能老老实实的在报告里说明，不要把不可靠的结果上传。
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